Επιστολή του Πρεβεζάνου Μιχάλη Λουκά, Ομ. Καθηγητή Γενετικής του Γ.Π.Α., π. Πρύτανη

Διάβασα με μεγάλο ενδιαφέρον από την Τ.Φ., στις 21/3/24, για την εκδήλωση με θέμα «Οι Παράγοντες Επιλογής Ελιάς: Κορωνέικη και Λιανολιά», που διοργανώθηκε, στις 21/2/24, στην «Θεοφάνειο Αίθουσα Τέχνης», από την ΔΑΟΚ Πρέβεζας και τον Σύλλογο Γεωπόνων Πρεβέζης. Οι ομιλίες, τόσο του Προέδρου του Συλλόγου κ. Τάσου Γάτσιου όσο και του εξαιρετικού επιστήμονα και ανθρώπου, φίλου Καθηγητή κ. Επαμεινώνδα Παπλωματά, που κοσμεί με την παρουσία του το Γ.Π.Α., ήταν εξαιρετικές. Θα ήθελα, όμως να σχολιάσω ή να προσθέσω ορισμένα συμπληρωματικά στοιχεία για την ελιά, που έχουν δημοσιευθεί από το Εργαστήριο Γενετικής του Γ.Π.Α. 1. Είναι ορθός ο όρος “ποικιλία” στην ελιά; Στα διπλοειδή είδη φυτών και ζώων, τα χρωματοσώματα βρίσκονται σε ζεύγη ομολόγων. Τα γονίδια αποτελούν τμήματα του DNA των χρωματοσωμάτων. Έτσι κάθε γονίδιο στα διπλοειδή μπορεί να έχει δύο διαφορετικές μορφές, μία σε κάθε ομόλογο, που ονομάζονται αλληλόμορφοι, π.χ. Α και α. Αν ένα γονίδιο έχει δύο ταυτόσημες μορφές, π.χ. αα ή ΑΑ, τότε ονομάζεται ομοζυγωτό για τον α ή τον Α αλληλόμορφο ή λέμε ότι ο οργανισμός έχει γονότυπο αα ή ΑΑ. Αν έχει τις μορφές Α και α, δηλαδή είναι Αα, τότε ονομάζεται ετεροζυγωτό. Στα φυτά μεγάλης καλλιέργειας, π.χ. σιτηρά, επιδιώκουμε τη δημιουργία καθαρών σειρών, δηλαδή ατόμων που είναι ομοζυγωτά για τον ίδιο αλληλόμορφο καθενός γονιδίου. Στην πράξη, αυτό επιτυγχάνεται συνήθως, σε ποσοστό περίπου 95% των γονιδίων, έπειτα από συνεχείς πέντε αυτογονιμοποιήσεις. Από τη διασταύρωση δύο διαφορετικών καθαρών σειρών προκύπτουν υβρίδια, που τα περισσότερα γονίδιά τους είναι ετεροζυγωτά. Υβρίδια χρησιμοποιούν οι καλλιεργητές, εκμεταλλευόμενοι το φαινόμενο της ετέρωσης, για τη βελτίωση των επιθυμών χαρακτήρων ενός φυτού ή εκτρεφόμενου ζώου. Στα ζώα η δημιουργία καθαρών σειρών είναι επίπονη, ελλείψει αυτογονιμοποίησης. Η προσέγγιση προς την ομοζυγωτία επιτυγχάνεται με συνεχείς διασταυρώσεις μεταξύ συγγενών ατόμων, π.χ. μεταξύ αδελφών, πρώτων εξαδέλφων κ.ά. Για τα περισσότερα από τα συστήματα τέτοιων διασταυρώσεων, η μαθηματική προσέγγιση προς την ομοζυγωτία δίνεται στα βιβλία του υποφαινόμενου «Γενετική Πληθυσμών. Τόμος Ι: Στατική και Δυναμική Μελέτη των Πληθυσμών» και «Τόμος ΙΙ: Ποσοτικοί Χαρακτήρες». Στις δενδρώδεις διπλοειδείς καλλιέργειες, τα πράγματα είναι διαφορετικά. Ο όρος “ποικιλία”, όπως στην ελιά και σε άλλα είδη, δεν ταυτίζεται με τη βοτανική και γενετική της σημασία. Γι’ αυτό διεθνώς, στις περιπτώσεις αυτές, αντί του όρου ποικιλία χρησιμοποιείται ο ορθός όρος cultivar («καλλιεργητική ή καλλιεργούμενη ποικιλία», Κ.Π.), επειδή, αν διασταυρωθούν δύο φυτά ελιάς της ίδιας Κ.Π., τότε προκύπτει μια μορφή αγριελιάς. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα φυτά μιας Κ.Π. διατηρούν μεγάλο βαθμό γενετικής ποικιλότητας, καίτοι έχουν τον ίδιο γονότυπο. Έτσι, αν ένα φυτό, π.χ. Αα, αυτογονιμοποιηθεί ή διασταυρωθεί με ένα άλλο της ίδιας Κ.Π., τότε θα προκύψουν απόγονοι ΑΑ ή Αα ή αα, δηλαδή φυτά με γονότυπο διαφορετικό εκείνου της Κ.Π. Επειδή αυτό συμβαίνει για τα χιλιάδες γονίδια του φυτικού οργανισμού, οι απόγονοι ουδεμία σχέση έχουν με την Κ.Π. από την οποία προέρχονται. Πώς, όμως, οι Κ.Π. διατηρούν τη γενετική τους ποικιλότητα; Στους διάφορους οργανισμούς έχουμε δύο είδη αναπαραγωγής: Την Αμφιγονική (Φυλετική ή Εγγενής) και την Μονογονική (Μη Φυλετική ή Αγενής). Στην πρώτη περίπτωση έχουμε ένωση δύο απλοειδών κυττάρων, των γαμετών (σπερματοζωάρια και ωάρια). Οι γαμέτες είναι απλοειδείς, επειδή περιέχουν μόνο ένα αντίγραφο (αλληλόμορφο) σε κάθε γονίδιο. Από την ένωσή τους προκύπτει το διπλοειδές άτομο. Στην αγενή αναπαραγωγή, τα ερμαφρόδιτα φυτά, πολλών δενδροκαλλιεργειών, πολλαπλασιάζονται με εμβόλια, παραφυάδες, καταβολάδες ή μοσχεύματα, ώστε όλοι οι απόγονοι να έχουν τον ίδιο γονότυπο. Μιλάμε, λοιπόν, για Κ.Π. και όχι για “ποικιλίες” ελιάς, καίτοι ο όρος αυτός έχει λανθασμένα ευρέως επικρατήσει. 2. Οι Κ.Π. ελιάς στη χώρα μας διακρίνονται βάσει μορφολογικών κριτηρίων, όπως σχήμα πυρήνα, σχήμα καρπού, μέγεθος καρπού, αυλακιές στους πυρήνες κ.ά. Όμως, οι χαρακτήρες αυτοί επηρεάζονται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, που προκαλούν φαινοτυπική ποικιλότητα. Γι’ αυτό μελετήθηκαν γενετικά χαρακτηριστικά 27 Κ.Π. ελιάς, χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα 16 ενζυμικά συστήματα που ελέγχονται από αντίστοιχα γονίδια: Εστεράσης, Μηλικού ενζύμου, Λευκίνης αμινοπεπτιδάσης, Πεπτιδάσης, Αφυδρογονάσης της 6-φωσφορογλυκόζης, Αφυδρογονάσης του γλουταμινικού, Φουμαράσης, Μηλικής αφυδρογονάσης, Αφυδρογονάσης του ισοκιτρικού, Αφυδρογονάσης της λευκίνης, Οξειδάσης του τετραζολίου, Τυροσινάσης, Φωσφορογλυκομουτάσης, Αφυδρογονάσης του α-γλυκεροφωσφορικού, Αλκαλικής φωσφατάσης και Αφυδρογονάσης της σορβιτόλης. (Ας σημειωθεί ότι για 7 από τα μελετηθέντα ενζυμικά συστήματα, οι μέθοδοι ανίχνευσής τους έχουν προταθεί και δημοσιευθεί το 1975 από τον υποφαινόμενο). Στις 27 Κ.Π. περιλαμβάνονται και oι ισπανικές Κ.Π. Manzanillo, Sevillano και Gordal που εισήχθησαν στη χώρα μας το 1950. Από τις 27 Κ.Π., τρεις είχαν μοναδικό φαινότυπο για καθένα από τρία διαφορετικά ενζυμικά συστήματα, πέντε Κ.Π. για καθένα από δύο ενζυμικά συστήματα και 12 Κ.Π. είχαν μοναδικό φαινότυπο για ένα μόνο ενζυμικό σύστημα. Οι γενετικοί φαινότυποι για το μηλικό ένζυμο και τις εστεράσες φανέρωσαν τη μεγαλύτερη διαφοροποίηση. Η διάκριση των περισσότερων Κ.Π. είναι δυνατή με τη χρησιμοποίηση μόνο των δύο αυτών ενζυμικών συστημάτων. Για μερικές Κ.Π. απαιτείται ένας συνδυασμός περισσότερων από 2 συστήματα, για την πλήρη διάκριση των Κ.Π. Μελετήθηκε, επίσης, και η εντός των Κ.Π. τυχόν γενετική παραλλακτικότητα, στις Κ.Π. Καλαμών, Κονσερβολιά, Καρυδολιά, Κορωνέικη και Μαστοειδής, λαμβάνοντας δείγματα από καθεμιά από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές. Π.χ. για την Καλαμών ελήφθησαν δείγματα από τις περιοχές Μεσσηνίας, Φθιώτιδας, Αιτωλοακαρνανίας και Αττικής και για την Κορωνέικη από τις περιοχές Μεσσηνίας, Λακωνίας, Χανίων και Αττικής. Σε όλες τις περιπτώσεις δεν ανιχνεύθηκε γενετική διαφοροποίηση εντός των Κ.Π., καίτοι μεταξύ των Κ.Π. ανιχνεύθηκε σημαντική γενετική διαφοροποίηση. Μια μικρή διαφοροποίηση παρατηρήθηκε στην Κ.Π. Καλαμών από την Φθιώτιδα. Όμως, ο δείκτης ομοιότητας (Similarity Index, S.I.) μεταξύ της Κ.Π. Καλαμών από τη Φθιώτιδα και των Κ.Π. Καλαμών από τις άλλες περιοχές ήταν 0,98. 3. Μελετήθηκε, επίσης, η ιστορία των Κ.Π. ελιάς με την εκτίμηση της μεταξύ τους γενετικής απόστασης (genetic distance, D) και τη δημιουργία ενός φυλογενετικού δένδρου (phylogenetic tree). Η βασική αρχή της Olea europaeα και η έναρξη της καλλιέργειάς της παραμένουν ασαφείς. Από τα περίπου 30 είδη του γένους Olea, θεωρείται από πολλούς συγγραφείς ότι ο άγριος προγονός τους είναι η O. chrysophylla και ότι το ενδιάμεσο είδος μεταξύ O. chrysophylla και O. europaeα είναι το είδος Ο. laperrini. Από ανασκαφές σε περιοχές της Ανατολικής Μεσογείου (μελετήθηκε το σχήμα του πυρήνα, η γύρις και το λάδι που βρέθηκε σε αρχαία δοχεία), φαίνεται ότι το αρχικό κέντρο της καλλιέργειας της O. europaeα είναι η Παλαιστίνη, ο Λίβανος, η βορειοδυτική Συρία και η Κύπρος. Στην Ελλάδα φαίνεται ότι αρχικά καλλιεργήθηκε στην Κρήτη και στις Κυκλάδες. Είναι βέβαιο ότι αργότερα καλλιεργήθηκε στην Ιταλία, Ισπανία, Β. Αφρική, ενώ στη Γαλλία εισήχθη από Έλληνες αποίκους. Σήμερα η καλλιέργειά της, αν και σε μικρότερο βαθμό, έχει επεκταθεί στην Αμερικανική Ήπειρο, Αφρική, Αυστραλία και Ιαπωνία. Γενικά θεωρείται ότι η καλλιέργεια της ελιάς άρχισε πριν περίπου από 6.500 χρόνια και στην Ελλάδα πριν από 4.500 χρόνια. Πριν από εκατοντάδες χρόνια άρχισε και ο αγενής πολλαπλασιασμός της ελιάς. Η Κ.Π. Γαїδουρολιά θεωρείται ότι ταυτίζεται με την Κ.Π. Gongylis των αρχαίων Ελλήνων και Ρωμαίων. Η Κολυμπάδα ότι είναι η αρχαία ελληνική Kolymbas και η Θρουμπολιά η αρχαία Drypepis ή Rysse. Τα κύρια χαρακτηριστικά του φυλογενετικού δένδρου είναι: α) Οι μικρόκαρπες Κ.Π. Λιανολιά και αμέσως μετά η Θιακή είναι οι αρχαιότερες ελληνικές Κ.Π. Τη Λιανολιά, που μοιάζει με άγριο δένδρο, την αποκαλούσαν οι αρχαίοι Στρεπτολιά από την ονομασία Στρέπτος, που έδιναν στις άγριες ελιές. Στην ίδια ομάδα ανήκει η μικρόκαρπη Μυρτολιά, οι μεγαλόκαρπες Κονσερβολιά και Καρυδολιά και η μεσόκαρπη Θρουμπολιά β) Ακολουθεί η αμάδα με τις περισσότερες μεγαλόκαρπες, όπως οι Στρογγυλολιά, Καρολιά, Γαїδουρολιά, Αμυγδαλολιά, Κολυμπάδα, Βασιλικάδα, Καλαμών, Μanzanillo, Sevillano και Gordal. Η αρχαιότερη Κ.Π. στην ομάδα αυτή είναι η μεσόκαρπη Μεγαρίτικη. Αυτό δεν εκπλήσσει, επειδή οι αρχικές Κ.Π. έχουν μικρό μέγεθος πυρήνα, όπως η “άγρια” O. europaea var. oleaster και η O. chrysophylla. Παρατηρούμε, επίσης, ότι η Βασιλικάδα συνδέεται στενά με τις ισπανικές Κ.Π. Ας σημειωθεί ότι σε ορισμένες περιοχές η Βασιλικάδα ονομάζεται και Ισπανική, πιθανά λόγω παλαιότερης εισαγωγής της από την Ισπανία. γ) Ακολουθεί η ομάδα που περιλαμβάνει τις μικρόκαρπες Κ.Π. Κουτσουρελιά, Μαυρελιά, Μαστοειδής, Τραγολιά και Κορωνέικη, τις μεσόκαρπες Βαλανολιά και Αδραμυττινή και τη μεγαλόκαρπη Κοθρέικη. δ) Το γεγονός ότι επαληθεύονται οι πιθανοί ισχυρισμοί παλαιότερων παν/κών δασκάλων ότι οι Κ.Π. Λιανολιά και Κορωνέικη είναι αντίστοιχα μια από τις αρχαιότερες και μια από τις νεότερες Κ.Π. στη χώρα μας και το γεγονός ότι οι περισσότερες μεγαλόκαρπες και οι περισσότερες μικρόκαρπες Κ.Π. εντάσσονται σε δύο διαφορετικές ομάδες, ενισχύει την αξιοπιστία της εφαρμοζόμενης γενετικής μεθόδου. Πιθανά – και επαναλαμβάνω πιθανά – οι μερικές μεγαλόκαρπες που εντάσσονται στις ομάδες της Λιανολιάς και των μικρόκαρπων, να είχαν εντοπισθεί στην ομάδα των μεγαλόκαρπων, εφόσον ήταν δυνατή η μελέτη περισσότερων ενζυμικών συστημάτων. ε) Μπορούμε γενικά να παρατηρήσουμε ότι το μέγεθος του καρπού αυξάνεται με τον χρόνο και ότι οι σύγχρονες μεγαλόκαρπες Κ.Π. εμφανίσθηκαν 2.000 χρόνια πριν. Βρέθηκε, επίσης, χρησιμοποιώντας και τα αρχαιολογικά ευρήματα, ότι υπάρχει ισχυρή θετική συσχέτιση (r = 0,76) μεταξύ βάρους καρπού και μήκους του πυρήνα. Οι μοντέρνες μικρόκαρπες Κ.Π., όπως η Κορωνέικη, πιστεύεται ότι προέρχονται από επιλογή σποροφύτων με επιθυμητούς χαρακτήρες. 4. Τέλος, μελετήθηκε η ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα του Δάκου της Ελιάς. Στη γεωργική πρακτική χρησιμοποιείται στη χώρα μας ένα ευρύ φάσμα εντομοκτόνων. Η επιλογή και η δοσολογία τους καθορίζονταν συνήθως εμπειρικά, με συνέπεια την αλόγιστη χρήση τους. Σύμφωνα με έκθεση της Ευρωπαїκής Επιτροπής το 2000, η χώρα μας βρίσκονταν στη δεύτερη θέση επικινδυνότητας για την υγεία από τα μολυσμένα με φυτοφάρμακα φρούτα και λαχανικά. Γενικά, με την αλόγιστη χρήση τους καταστρέφεται το περιβάλλον (μόλυνση φυσικών πόρων, εξαφάνιση ωφέλιμων ειδών), ενώ υπάρχει σοβαρός κίνδυνος για την υγεία αγροτών και καταναλωτών. Πολύ συνοπτικά, οι στόχοι των εντομοκτόνων εντοπίζονται κυρίως στο νευρικό σύστημα. Τα οργανοφωσφορικά και καρβαμιδικά εντομοκτόνα δεσμεύονται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου της ακετυλοχολινεστεράσης, που καταλύει την υδρόλυση της ακετυλοχολίνης, αναστέλλοντας τη λειτουργία της. Τα οργανοχλωρικά και οι πυρεθρίνες στοχεύουν διαμεμβρανικά κανάλια μεταφοράς ιόντων χλωρίου και νατρίου, οδηγώντας τελικά στην παράλυση και στον θάνατο του εντόμου. Τα έντομα αντιδρούν στα εντομοκτόνα με διάφορους μηχανισμούς άμυνας, όπως π.χ. με δέσμευση και μεταβολισμό των εντομοκτόνων σε λιγότερο τοξικά μόρια πριν φθάσουν στον στόχο τους. Τα βασικά ένζυμα αυτής της κατηγορίας είναι οι εστεράσες, οι μονοοξυγονάσες και οι τρανσφεράσες του γλουταθείου. Άλλος μηχανισμός άμυνας είναι οι διαφοροποιήσεις της μοριακής δομής των πρωτεїνών στόχων. Τέτοιες αλλαγές στη στερεοδομή της ακετυλοχολινεστεράσης, την καθιστούν λιγότερο προσπελάσιμη στα οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα. Ανάλογες αλλαγές στις διαμεμβρανικές πρωτεїνες μεταφοράς ιόντων μειώνουν τη συνάφεια των οργανοχλωρικών και πυρεθροειδών εντομοκτόνων με τις πρωτεΐνες αυτές. Τυχόν αλλαγές στα ενζυμικά πρωτεїνικά μόρια, που οφείλονται σε μεταλλάξεις στα γονίδια που τις κωδικοποιούν, καίτοι αυτές είναι σπάνιες, τελικά επιτρέπουν τη δημιουργία ενός ανθεκτικού πληθυσμού εντόμων, σε αντικατάσταση του προηγούμενου ευαίσθητου, λόγω του υψηλού βαθμού αναπαραγωγής των εντόμων. Στον δάκο της ελιάς, καίτοι έχουν χρησιμοποιηθεί φερομόνες, μαζικές παγίδες και ακόμη απελευθέρωση στείρων εντόμων (η τελευταία μέθοδος δεν χρησιμοποιείται πλέον, επειδή η αποτελεσματικότητά της στον δάκο είναι μηδαμινή, όπως απέδειξαν πειράματα στο Εργαστήριο Γενετικής, που δεν είναι του παρόντος να αναπτύξω), η χημική καταπολέμηση παραμένει το βασικό εργαλείο καταπολέμησης. Όμως, οι συνεχείς ψεκασμοί με οργανοφωσφορικά δημιουργούν μια ισχυρή επιλεκτική πίεση των ανθεκτικών ατόμων. Στο Εργαστήριο εκτρέφαμε επί 15 συνεχή έτη πληθυσμούς δάκου για άλλα πειράματα. Οι πληθυσμοί αυτοί ουδέποτε ψεκάστηκαν και επομένως, σύμφωνα με την υπόθεσή μας, πρέπει να είναι ευαίσθητοι στο εντομοκτόνο. Συλλέξαμε, λοιπόν, άτομα δάκου από ελαιώνα που ψεκάζονταν ανελλιπώς με Dimethoate. Τα αποτελέσματα ήταν εντυπωσιακά. Τα συλλεγέντα άτομα χρειάζονταν έως και 10 φορές μεγαλύτερη δόση του εντομοκτόνου, για να θανατωθεί το 50% του πληθυσμού συγκριτικά με τα ευαίσθητα άτομα του Εργαστηρίου. Η χρήση ενζυμικών παρεμποδιστών και η βιοχημική ανάλυση των ενζυμικών συστημάτων, που συνδέονται με την ανθεκτικότητα, έδειξε ότι στα ανθεκτικά άτομα εκφράζεται μια άλλη ακετυλοχολινεστεράση. Σχεδιάζοντας εκκινητές σε συντηρητικές περιοχές του ενζύμου και χρησιμοποιώντας μοριακές τεχνικές, απομονώθηκε το γονίδιο της ακετυλοχολινεστεράσης. Συγκρίνοντας τις αλληλουχίες αμινοξέων των ενζύμων μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων ατόμων (με μια πολύπλοκη μοριακή διαδικασία), διαπιστώθηκε η ύπαρξη μιας σημειακής μετάλλαξης, που οδηγούσε σε αντικατάσταση του αμινοξέος γλυκίνη από το αμινοξύ σερίνη. Η ανάλυση της κρυσταλλογραφικής δομής της ακετυλοχολινεστεράσης, έδειξε ότι η θέση του συγκεκριμένου αμινοξέος βρίσκεται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Πείραμα προσομοίωσης έδειξε ότι η αντικατάσταση της γλυκίνης (του μικρότερου αμινοξέος) με σερίνη προκαλεί τη μειωμένη πρόσβαση του ογκώδους μορίου του Dimethoate, με συνέπεια την ανθεκτικότητα. Περαιτέρω βρέθηκε και μια άλλη μετάλλαξη (αντικατάσταση της ισολευκίνης από το αμινοξύ βαλίνη), γεγονός που αυξάνει ακόμη περισσότερο την ανθεκτικότητα. Τέτοιες αλλαγές διαπιστώθηκαν για πρώτη φορά σε έντομο οικονομικής σημασίας, όπως ο δάκος της ελιάς. Το επόμενο στάδιο θα ήταν η μελέτη της ανθεκτικότητας του δάκου σε ελαιώνες από διαφορετικές περιοχές της χώρας και ταυτόχρονα η τυχόν διαπίστωση διαφοροποίησης του βαθμού ανθεκτικότητας μεταξύ των διάφορων Κ.Π. Η έρευνα αυτή απαιτούσε χρηματοδότηση όχι μόνο για τα πανάκριβα χημικά αντιδραστήρια, αλλά και για να καλυφθούν οι δαπάνες του προσωπικού που θα έκαναν τις συλλογές των εντόμων. Αν ένας πληθυσμός έχει υψηλό βαθμό ανθεκτικότητας, τότε θα ήταν άσκοπη η χρήση οργανοφωσφορικών, που αυξάνει και το κόστος παραγωγής και είναι εξαιρετικά επικίνδυνη για το περιβάλλον. Το υπουργείο Γεωργίας στο οποίο αποταθήκαμε, πριν δημοσιευθούν τα αποτελέσματα της έρευνάς μας, αφού αυτά αφορούσαν κυρίως τη χώρα μας, αγνόησε το αίτημά μας. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών, που έγιναν την περίοδο 1979 – 1981, απετέλεσαν το αντικείμενο πέντε δημοσιεύσεων, δύο σε ελληνικά περιοδικά (ΒΙΟ και «Γεωργική Έρευνα») και τρεις στο διεθνές έγκυρο επιστημονικό περιοδικό «Journal of Horticultural Science». Με εκτίμηση, Μιχάλης Λουκάς, Ομ. Καθηγητής Γενετικής του Γ.Π.Α., π. Πρύτανις